روشهای تشخیص درگیری پرندگان با باکتری مایکوپلاسما سینویا ( MS )

بیماری با مایکوپلاسما سینویا ( MS ) در اکثر موارد ، به صورت بیماری تحت بالینی مجاری فوقانی تنفسی روی می دهد . بیماری فوق زمانی که با بیماریهایی چون نیوکاسل ، برونشیت یا هردو ترکیب گردد ، میتواند سبب بروز ضایعاتی در کیسه های هوایی شود .

---

روشهای تشخیص درگیری طیور با باکتری مایکوپلاسما سینویا ( MS )
تهیه و تنظیم :
علیرضا گائینی ، دانشجوی رشته دکترای دامپزشکی ، دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرمسار .
Alirezagaeeni@VetNews.Ir
معرفی :
بیماری با مایکوپلاسما سینویا  در طیور  در اکثر موارد ، به صورت بیماری تحت بالینی مجاری فوقانی تنفسی روی می دهد . بیماری فوق زمانی که با بیماریهایی چون نیوکاسل ، برونشیت یا هردو ترکیب گردد ، میتواند سبب بروز ضایعاتی در کیسه های هوایی شود .
در سایر موارد ، درگیری با MS میتوان بصورت نوعی بیماری عمومی ظاهر شده و در نتیجه ، سبب بروز علائمی در سینوس ها گردد . ایجاد بیماری به صورت حاد یا مزمن در جوجه ها و بوقلمون ها ، عمدتا شامل ضایعاتی در غشای سینویال مفاصل و صفحات تاندونی می باشد . این ضایعات با Exudative Synovitis ، Tenovaginitis یا التهاب بورس ، همراه می باشد .
تاریخچه :
این بیماری ، نخستین بار ، توسط Ollsen و همکاران ، توصیف شد و سپس با مایکوپلاسماها ارتباط داده شد . فرم تنفسی این بیماری به دنبال درگیری با مایکوپلاسما سینویا روی می دهد . به نظر می رسد که برخی جدایه های MS درصورتیکه با زمان واکسیناسیون برعلیه بیماری هایی چون IB و ND مقارن باشد ، سبب بروز ضایعاتی در کیسه های هوایی میشود .
سبب شناسی :
طبقه بندی :
کلونی های مایکوپلاسما به صورت صفحات ماهواره مانند قابل مشاهده هستند . Chalquest و Fabricant برای نخستین بار ، میان کلونی های این باکتری و میکروکوکوس تفاوت هایی را شناسایی نمودند . این دو محقق با ذکر این نکته که میکروکوکوس نیازمند نیکوتین آمید آدنین نوکلوئوتید می باشند ، کلونی های دو باکتری یاد شده را یکدیگر تفریق نمودند .
پس از آن ، مطالعات فراوانی بر روی مایکوپلاسماها صورت پذیرفت و نام مایکوپلاسما سینویا بعنوان گونه ایی مجزا ، انتخاب گردید . شناسایی و تشخیص کلونی این باکتری عموما بر اساس فاکتورهایی چون شکل شناسی سلولی ، خصوصیات بیوشیمیایی ، نیازمندی های رشد و همچنین ، واکنش های سرم شناسی صورت می پذیرد .
استفاده از روش ایمنوفلورسانس ، برای شناسایی کلونی های مایکوپلاسما ، از جمله روش های سریع و قابل اعتماد میباشد . روش فوق را میتوان در جهت شناسایی جدایه های به دست آمده از مزارع استفاده نمود .
این نکته به اثبات رسیده است که بررسی سکانس ژن 16S Rrna از DNA ، جهت شناسایی مایکوپلاسما در مطالعات فیلوژنیک ، مفید واقع خواهد شد . هست ثابت تا باشد مفید برای شناسایی مایکوپلاسما در مطالعات فیلوژنتیک . بهره گیری از PCR – RFLP در ژن 16S Rrna نبز در جهت شناسایی گونه های خاص مایکوپلاسما ، همانند مایکوپلاسما سینویا ارزشمند است . با استفاده از رویه های مشابه نیز میتوان فضای بین 16S تا 23S در ژنهای Rrna را مورد بررسی قرار داد .
ریخت شناسی کلونی ها :
کلونی های ایجاد شده توسط این باکتری را در محیط کشت جامد ، بهتر میتوان مشاهده نمود . کلونی های فوق را در میکروسکوپی با بزرگنمایی 30 و با استفاده از نور غیرمستقیم ، مشاهده می کنند . به لحاظ ظاهری ، کلونی های فوق مدور بوده و با محوریت مرکزی میباشند . اندازه این کلونی ها بطور معمول با توجه به تعداد کلونی های حاضر ، و مناسب بودن محیط کشت ، بین یک تا سه میلی متر میباشند . باکتری فوق ، بین سه تا پنج روز در محیط های جامد رشد خواهند کرد .
حساسیت نسبت به عوامل فیزیکی و شیمیایی :
تاکنون گزارشی مبنی بر مقاومت این باکتری نسبت به ضدعفونی کننده ها منتشر نشده است ولی احتمال آن میرود که شباهت زیادی به سایر مایکوپلاسماها داشته باشد . در یک مطالعه تجربی ، محلی آلوده مورد پاکسازی قرار گرفت و ضدعفونی شد و سپس به مدت یک هفته تحت چنین شرایطی باقی ماند . در مرحله بعدی ، جوجه های یکروزه سالم را در این محل تحت پرورش قرار دادند . آزمایشات صورت پذیرفته بر روی این جوجه ها ، عدم آلودگی آنها را به اثبات رسانید .
اما بر اساس آزمایشات صورت پذیرفته این نکته به اثبات رسیده است که باکتری فوق در PH ، 6.8 یا پائین تر ، ماندگار نخواهد بود .
مایکوپلاسما سینویا به دمای بیش از 39 درجه سانتی گراد حساس است . این درحالیست که بر اساس گزارشات منتشر شده ، باکتری یاد شده نسبت به انجماد مقاوم است . از سوی دیگر بایستی توجه داشته باشید که میزان تیتر در شرایط انجماد کاهش خواهد یافت .
اگرچه آزمایشات دقیقی بر روی میزان مقاومت این باکتری در شرایط مختلف صورت نپذیرفته است ، اما به نظر می رسد که ماندگاری این باکتری در محیط رشدی که حاوی زرده تخم مرغ باشد ، بالا باشد . بر اساس برخی گزارشات منتشر شده ، باکتری فوق در دمای 63 –  درجه سانتی گراد حداقل به مدت هفت سال باقی می ماند .
این در حالیست که دمای 20 –  درجه سانتی گراد ، سبب ماندگاری این باکتری به مدت دو سال خواهد شد . اما در آزمایشاتی جداگانه ، این نکته به اثبات رسید که محیط کشت Broth بدست آمده در 70 –  درجه سانتی گراد ، و همچنین ، محیط کشت لئوفیلیزه بدست آمده در 4 درجه سانتی گراد ، برای سالهای متمادی باقی خواهند ماند .
این باکتری به مدت سه روز در دمای اطاق ، به صورت فعال ، باقی مانده است . این درحالیست که باقی ماندن مایکوپلاسما سینویا به مدت دوازده ساعت در حفره بینی ، به اثبات رسیده است . از سوی دیگر ، با استفاده از تکنیک هایی چون PCR ، MS را از نمونه های محیطی چون پرها ، ذرات گرد و غبار ، غذا ، آب آشامیدنی و مدفوع ، جدا کرده اند .
ساختار آنتی ژنی :
آنتی ژنهای این باکتری توسط روشهای ارزیابی آزمایشگاهی چون آگلوتیناسون سرم بر روی پلیت ( SPA ) ، آگلوتیناسیون در لوله آزمایش ( TA ) ، هماگلوتیناسون ، روش AGP و الایزا مطالعه شده اند . از سوی دیگر ، یکی از پروتئین های اصلی این باکتری ، موسوم به p41 توسط روش الایزای نقطه ایی به خوبی مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفته است .
این در حالیست که پروتئین های p53 و p22 ، هنوز به خوبی بررسی نشده اند . توجه داشته باشید که اندازه ملکولی پروتئین های غشایی اصلی ، در سویه های مختلف MS متفاوت است . سرم بدست آمده از جوجه های آلوده شده با MS سبب آگلوتینه شدن آنتی ژن مایکوپلاسما گالی سپتیکم خواهد شد . این درحالیست که بعکس مورد یاد شده کمتر رخ می دهد .
Robert و Olesuik این نکته را دریافتند که واکنشهای متقاطعی از این دست ، با حضور فاکتور rheumatoid مرتبط بوده وسبب بروز واکنشهای بافتی نیز می شود .
واکنشهای متقاطعی در هنگام انجام آزمایشاتی چون HI یا TA روی میدهد . از سوی دیگر ، اپیتوپ های منتشر شده مایکوپلاسما گالی سپتیکم و مایکوپلاسما سینویا نیز از اهمیت ویژه ایی برخوردار هستند . اما توجه داشته باشید که در حال حاضر ، آنتی بادی های منوکلونال خاصی نیز برعلیه MS تولید شده است و رسپتورهای ایمنوگلوبولین G Fc نیز شناسایی شده اند .
جداسازی و شناسایی :
با جداسازی و سپس شناسایی مایکوپلاسما سینویا میتوان به نوعی تشخیص قطعی در مورد این بیماری دست یافت . جداسازی این باکتری از ضایعات ، در پرندگانی که بصورت حاد درگیر شده اند سخت نیست ، ولی در مراحل مزمن بیماری ، ارگانیسم های قابل دوامی در ضایعات باقی نخواند ماند.
این درحالیست که به نظر می رسد ، جداسازی باکتری فوق از مجاری فوقانی تنفسی در پرندگانی که بصورت مزمن با این بیماری درگیر شده اند ، عملی تر است . از تکنیک آنتی بادی فلورسنت نیز میتوان در جهت شناسایی کلونی یا کلونی های دست نخورده این باکتری استفاده نمود .
در برخی متون علمی نیز مباحثی در مورد تشخیص مستقیم DNA مایکوپلاسما سینویا در بافت یا محیط کشت ، مطرح شده است . روش فوق ، از انواع تکنیک های ساده و سریع میباشد ولی به نظر میرسد که حساسیت آن کافی نباشد .
PCR از انواع روش های تشخیصی سریع ، ساده و بسیار حساس میباشد . با استفاده از این تکنیک میتوان ، DNA مایکوپلاسما سینویا را در بافت یا محیط کشت ، شناسایی نمود . در حال حاضر ، انواع کیت های مختلف PCR در مقیاس تجاری در دسترس میباشد .
سرم شناسی :
درحال حاضر ، انواع آنتی ژنهای تجاری جهت انجام آزمایش SPA در دسترس میباشند . اطلاعات مورد نیاز در مورد نحوه استفاده از این محصولات نیز در بسته بندی آنها موجود است . در این آزمایشات ، عموما 0.02 میلی لیتر از سرم را با مقدار مساوی آنتی ژن در پلیتی شیشه ایی مجاور ساخته و سپس محتوای به دست آمده را به آرامی حرکت می دهند و میزان فعالیت آگلوتیناسون را تحت نظر قرار می دهند .
توجه داشته باشید که آنتی ژن مورد استفاده در این آزمایش را بایستی به صورت روزانه با سرم هایی که به لحاظ مثبت یا منفی بودن شناخته شده هستند ، مورد ارزیابی قرار داد .
بر اساس مطالعات صورت پذیرفته ، نهایتا بین دو تا چهار هفته ، آنتی بادی ها در بدن پرندگان بیمار گسترش می یابند .
به اعتقاد بسیاری از صاحب نظران ، آزمایش SPA ممکن است در مواردی نیز باشد غیرحساس بوده و واکنش لازم صورت نپذیرد . Ewing و همکاران گزارش نمودند که نتایج آزمایش SPA در برخی گله های مادر و تخمگذار تجاری با منفی های کاذب همراه است . این گروه از محققین از تکنیک الایزا ، جهت انجام آزمایشات تکمیلی استفاده کرده بودند .
این در حالیست که در برخی گله ها نیز هیچ واکنش خاصی در هنگام بررسی نمونه سرم ها توسط آزمایش SPA روی نمی دهد .  چنین مواردی به خصوص در گله هایی مشاهده میشود که با واکسن های روغنی برعلیه انواع عوامل بیماری زا واکسینه شده اند . از سوی دیگر ، به منظور تایید صحت آزمایشات صورت پذیرفته ، بایستی از تکنیک HI بهره بریم .
از سوی دیگر ، برخی محققین نیز از آزمایش ایمنوپروکسیداز غیرمستقیم با استفاده از کلونی های مایکوپلاسمای دست نخورده بعنوان زیرلایه به شناسایی آنتی بادی ها در سرم ، ترشحات تنفسی ، مایع سینویال ، صفرا ، غدد Harderian ، اویداکت و زرده پرداخته اند .
به طور معمول ، آزمایش الایزا جهت سنجش روزانه گله ها مورد استفاده قرار می گیرد . به نظر می رسد که در آینده ایی نزدیک ، آزمایش فوق جایگزین روش هماگلوتیناسیون شده و در بررسی های اولیه نیز مورد استفاده قرار گیرد . انواع کیت های الایزا در سطح تجاری ، جهت انجام این آزمایش ، در دسترس میباشند .
محققین با استفاده از روش تغلیظ و آماده سازی اولیه آنتی ژنها در ناحیه p46 تا p52 ، به دسته ایی از آنتی ژنها جهت استفاده در آزمایش الایزا دست یافته اند . استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب در دامنه های آنتی ژنی بالا ( MSPB ) نیز از روشهای بسایر مناسب جهت تشخیص سرمی این باکتری است .  
بنابراین ، تایید قطعی نتایج سرم شناسی ، منوط به جداسازی و شناسایی مایکوپلاسما سینویای به دست آمده از مجاری فوقانی تنفسی ، با استفاده از تکنیک  PCR می باشد .
توجه داشته باشید که بوقلمون ها ، به دنبال بیماری های تنفسی ، سطح پائینی از آنتی بادی ها را برعلیه این باکتری تولید می کنند . بنابراین ، احتمال آن میرود که استفاده از روش آگلوتیناسیون ، در بررسی وضعیت آلودگی مایکوپلاسما سینویا در این گله ها موثر نباشد .
این درحالیست که براساس نتایج تحقیقات به عمل آمده ، آنتی بادی های مشخص برعلیه این بیماری ، تنها پس از تلقیح در کف پا ، به خوبی گسترش می یابند . از سوی دیگر ، آنتی ژنهای تجاری متفاوتی در جهت شناسایی این باکتری در بوقلمون ها ، با روش آگلوتیناسیون در دسترس می باشد .
تحت برخی شرایط خاص ، ممکن است نوعی تاخیر در پاسخ آنتی بادی ، در جوجه ها روی دهد . چنین مواردی را میتوان با استفاده از تکنیک PCR ، شناسایی نمود .
در برخی موارد خاص ، بوقلمون هایی که به صورت عمومی درگیر شده بودند ، نوعی پاسخ آنتی بادی قوی را برعلیه این باکتری گسترش دادند . بر اساس بررسی های صورت پذیرفته ، این نکته به اثبات رسیده است ، آن دسته از پرندگانی که آنتی بادی های مورد نیاز را در مجاری فوقانی تنفسی خود گسترش نداده بودند ، با این باکتری درگیر شده بودند .
تاخیر در تولید آنتی بادی های در حال چرخش نیز از جمله مواردی است که سبب قرارگیری پرندگان ، در این گروه میشود . در برخی موارد نیز جهت تشخیص این بیماری به HI ، PCR یا محیط کشت نیاز خواهد بود .
تشخیص تفریقی :
بر اساس برخی نشانه ها چون تاج رنگ پریده ، لاغری ، مشکلات پا ، تاول در سینه ، بزرگ شدن کف پا یا مفصل زانو ، بزرگ شدن طحال ، و بزرگ شدن کبد یا کلیه ها ، میتوان به نوعی تشخیص اولیه دست یافت . اما توجه داشته باشید که التهاب مفاصل دلایل متعددی دارد و تشخیص قطعی شما بایستی بر اساس رویه شناسایی باکتری در آزمایشگاه ، صورت پذیرد .
از سوی دیگر ، توجه داشته باشید که استافیلوکوکوس اورئوس ، اشرشیا کولای ، پاستورلا و سالمونلا نیز میتوانند از دلایل اولیه ابتلا به Synovitis باشند . این در حالیست که مایکوپلاسما گالی سپتیکم نیز میتواند سبب بروز ضایعات مفاصل و تاول در سینه باشند .
فیبروز منبسط کننده metatars یا تاندون های منبسط کننده انگشتان و تصفیه لنفوسیتی میوکاردیوم مرتبط با عوامل التهاب مفاصل ویروسی به ما کمک میکنند تا آنها را از مایکوپلاسما سینویا ، متفاوت سازیم .
سرم بدست آمده از جوجه های درگیر با tensynovitis ویروسی با آنتی ژنهای MS آگلوتینه نمیشوند ، ولی بایستی این نکته را در ذهن داشته باشید که آگلوتینین MS ، ممکن است بدون درگیری قبلی مفاصل روی دهد . در مواردی  که با درگیری قبلی تنفسی با مایکوپلاسما گالی سپتیکم مواجه هستیم ، مورد فوق را بایستی از سایر دلایل بیماری تنفسی تفریق نمائیم .
منبع :
Disease Of Poultry , 11Th Edition .